La diagnostica di laboratorio per COVID-19

Gian Maria Rossolini

  

Gian Maria Rossolini
Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica, Università degli Studi di Firenze.SOD Microbiologia e Virologia, AOU Careggi, Firenze

 

“Sono necessarie altre ricerche sul campo. Altre campionature di animali selvatici. Altri esami sui genomi. Una maggior consapevolezza del fatto che le infezioni animali possono diventare infezioni umane, perché gli esseri umani sono animali. Viviamo in un mondo di virus e a malapena abbiamo iniziato a comprenderlo”
David Quammen, Perché non eravamo preparati


Le infezioni da SARS-CoV-2

Da oltre un anno la pandemia di COVID-19 sta impegnando duramente i sistemi sanitari a livello globale per la sua elevata morbosità e mortalità.
L’agente eziologico del COVID-19 è un nuovo coronavirus zoonotico, SARS-CoV-2, filogeneticamente correlato al coronavirus della SARS (SARS-CoV) che aveva a suo tempo suscitato grande preoccupazione senza tuttavia riuscire a diffondersi a livello pandemico.

Analogamente agli altri membri della famiglia Coronaviridae, SARS-CoV-2 è un virus con genoma a RNA monocatenario di polarità positiva e dimensioni relativamente grandi (circa 30 kb), provvisto di un capside a simmetria elicoidale e di un envelope su cui si impiantano le spicule proteiche (proteina spike) tipiche di questa famiglia, con cui il virus si lega al recettore ACE-2 presente sulla membrana delle cellule bersaglio.

A differenza di altri virus a RNA, in SARS-CoV-2 l’enzima che replica il genoma virale (replicasi) è provvisto di attività proofreading, che garantisce una elevata fedeltà nel processo di replicazione dell’RNA genomico, limitando la variabilità genetica del virus. Tuttavia, una certa variabilità resta possibile e di fatto ha condotto all’emergenza di numerose varianti del virus nel corso dell’evoluzione della pandemia. Alcune di queste varianti (ad esempio la cosiddetta variante inglese) hanno mostrato una capacità di trasmettersi con maggiore efficacia, quindi di diffondersi rapidamente in certe aree geografiche dove hanno largamente rimpiazzato i ceppi virali presenti in precedenza. La preoccupazione generata dalle varianti del virus è legata non solo a una presunta maggiore trasmissibilità ma anche alla possibilità che alcune varianti riescano a eludere almeno in parte l’immunità indotta dall’infezione naturale o dai vaccini rendendo possibili reinfezioni in soggetti guariti e infezioni in soggetti vaccinati.

La diagnostica di laboratorio per le infezioni da SARS-CoV-2

La diagnostica di laboratorio per le infezioni da SARS-CoV-2 ha avuto un rapido sviluppo con l’avvento della pandemia, ed è entrata a far parte dell’offerta dei servizi diagnostici di Microbiologia e Virologia delle Aziende Sanitarie pubbliche e anche di numerosi laboratori privati.

I quesiti diagnostici sono molteplici:

• confermare i casi di COVID-19 che possono essere sospettati sulla base di un quadro sindromico tipico, ma anche presentarsi con quadri atipici. Di fatto, le infezioni da SARS-CoV-2 possono presentarsi con una discreta variabilità dei quadri sintomatologici, che vanno dalle polmoniti di varia gravità a semplici sindromi respiratorie superiori, sindromi gastro-intestinali, forme paucisintomatiche e forme asintomatiche, e l’approfondimento diagnostico è necessario per confermare se si tratta effettivamente di un caso di COVID-19;

• individuare i casi di infezione asintomatica che rappresentano un elemento di particolare importanza ai fini della trasmissione dell’infezione e uno dei fattori che hanno facilitato la rapida diffusione del virus a livello pandemico. L’individuazione delle infezioni asintomatiche consente di procedere rapidamente all’isolamento dei casi e alla quarantena dei contatti e prevenire la circolazione di infetti asintomatici in contesti a elevato rischio di diffusione (ad es. ospedali, RSA, scuole, fabbriche). Negli ospedali, ad esempio, lo screening per la presenza di infezioni asintomatiche da SARS-CoV-2 riguarda i pazienti che accedono al ricovero, gli operatori sanitari e tutto il personale in formazione che frequenta la struttura ospedaliera (tirocinanti, specializzandi);

• certificare un’avvenuta guarigione virologica. Questo aspetto era inizialmente richiesto prima di interrompere le procedure di isolamento conseguenti a un’infezione. Attualmente la conferma dell’avvenuta guarigione virologica non è più necessaria per interrompere le procedure di isolamento sociale, ma può essere richiesta la reintroduzione del soggetto in particolari contesti lavorativi come ad esempio le strutture sanitarie;

• valutare lo stato immunitario del soggetto nei confronti del virus. Questo aspetto è rilevante per gli studi di prevalenza dell’infezione a livello di popolazione e per valutare la risposta alla vaccinazione. La conoscenza dello stato immunitario nei confronti di SARS-CoV-2 può essere utile anche nella conferma diagnostica di alcuni casi.

Le metodiche diagnostiche e le loro applicazioni

Come per tutti gli agenti infettivi, la diagnostica per SARS-CoV-2 può basarsi su un approccio diretto, che consiste nella ricerca del virus o di sue componenti nei campioni biologici oppure su un approccio indiretto che consiste nella ricerca di una risposta immunitaria virus-specifica.

Fig 1 rossolini

L’approccio diretto può prevedere: 1) la ricerca del genoma virale, mediante tecniche di amplificazione genica (NAAT) tipo PCR real-time (rtPCR) o transcription-mediated amplification (TMA) previa retrotrascrizione del genoma virale da RNA a cDNA; 2) la ricerca di antigeni virali, mediante tecniche immunometriche; 3) l’isolamento del virus in colture cellulari.

La ricerca del genoma virale mediante metodiche NAAT resta a tutt’oggi la metodica di riferimento per la ricerca di SARS-CoV-2 nei campioni clinici. Un risultato positivo del test NAAT per SARS-CoV-2 indica la presenza di un’infezione in atto.

Tale metodica viene generalmente eseguita su tampone naso-faringeo (TNF), ma può essere utilizzata anche con altri tipi di campioni biologici. In particolare, la ricerca del virus in campioni provenienti dalle basse vie respiratorie (BAS, BAL) è indicata per conferma in caso di negatività del test molecolare eseguito su TNF ma forte sospetto clinico di COVID-19.

La maggior parte delle metodiche NAAT utilizzate sono qualitative, anche se con quelle basate su rtPCR il valore di ciclo soglia (Ct) delle curve di amplificazione fornisce un’indicazione sulla carica virale. In particolare, se il risultato del test è positivo ma il valore di Ct risulta > 35, il campione viene considerato come positivo a bassa carica.

Esistono numerosi sistemi per la ricerca di SARS-CoV-2 con metodiche NAAT, validati per uso diagnostico. Alcuni di questi lavorano in batch e consentono l’analisi di numeri elevati di campioni in tempi di 4-5 ore. Altri lavorano su pochi campioni o su singolo campione e consentono tempi di risposta più rapidi (anche inferiori a un’ora) a fronte di una minore processività.

La ricerca degli antigeni virali può essere fatta con metodiche immunometriche. Attualmente esistono vari sistemi per la ricerca degli antigeni virali.

Alcuni di questi sono basati su sistemi di cromatografia in flusso laterale, a lettura colorimetrica o fluorimetrica. La lettura è effettuata direttamente dall’operatore visualizzando una banda colorata che compare sul dispositivo (con i sistemi colorimetrici) oppure mediante un apposito lettore portatile (con i sistemi a lettura fuorimetrica), con tempi di risposta rapidi che variano dai 3 ai 30 minuti. I vantaggi principali di questi sistemi sono la rapidità e la semplicità, che ne consentono anche un uso decentrato (in modalità POCT), ad esempio direttamente presso un drive-through o un ambulatorio dedicato. Il principale limite, invece, è rappresentato da una minore sensibilità e specificità rispetto ai test molecolari. Per questo motivo, nel caso di un risultato negativo ottenuto con questi test in presenza di sospetto clinico o di fattori di rischio per COVID-19, è consigliabile confermare la negatività con un test molecolare. D’altra parte, in caso di positività del test, può essere opportuno confermare la positività con un test molecolare specialmente se si tratta di un soggetto asintomatico in un contesto epidemiologico a bassa prevalenza di COVID-19.

Oltre ai precedenti, esistono anche sistemi per la ricerca quantitativa degli antigeni virali basati su metodiche chemioimmunofluorimetriche, che presentano una sensibilità paragonabile a quella dei test molecolari. In questi casi sono necessarie apparecchiature dedicate, che richiedono l’esecuzione del test in laboratorio. Si tratta comunque di sistemi rapidi (risultati in meno di un’ora) e a elevata processività.

L’isolamento del virus in coltura richiede tempi relativamente lunghi e laboratori specificamente attrezzati. Per tali motivi, ancorché indispensabile per finalità di ricerca, non è utilizzabile nella routine diagnostica.

La diagnostica sierologica per SARS-CoV-2 è basata sulla ricerca degli anticorpi prodotti nei confronti degli antigeni del virus in seguito a infezione naturale o vaccinazione. I sistemi diagnostici a disposizione consentono di determinare la presenza di anticorpi sierici nei confronti di preparati di proteine virali totali o di singole componenti del virus, quali la proteina del nucleocapside (proteina N) o la proteina spike (proteina S).

La ricerca degli anticorpi può essere utile negli studi di sieroprevalenza e per una conferma diagnostica di casi di sospetto COVID-19 che siano risultati ripetutamente negativi al test molecolare. In questi casi, la comparsa di anticorpi specifici a partire dalla 2-3° settimana di malattia può confermare l’avvenuta infezione. La ricerca degli anticorpi è utile anche per valutare la risposta alla vaccinazione. In questo caso dovranno essere ricercati gli anticorpi anti-proteina S che sono gli unici a essere prodotti in seguito a vaccinazione, mentre la presenza di anticorpi anti-proteina N si riscontrerà solo in caso di pregressa infezione.

Conclusioni

La diagnostica per le infezioni da SARS-CoV-2 ha subito uno sviluppo rapido a seguito della comparsa e della diffusione della pandemia di COVID-19 ed è un campo in rapida evoluzione. I presidi diagnostici attualmente disponibili consentono di inquadrare rapidamente e con elevata affidabilità i casi di infezione sintomatica e di monitorare la presenza di infezioni asintomatiche nella popolazione mediante screening periodici o mirati. La carenza di presidi diagnostici per SARS-CoV-2, verificatasi nelle prime fasi della pandemia è stata largamente superata, mentre i laboratori di diagnostica microbiologica hanno dovuto rivedere rapidamente la loro organizzazione per far fronte alle modificate esigenze diagnostiche.

La comparsa delle nuove varianti virali potenzialmente associate a una maggiore diffusibilità e a fenomeni di immuno-escape rappresenta una nuova sfida per la diagnostica di laboratorio di SARS-CoV-2. A questo riguardo, i laboratori regionali di riferimento sono impegnati nella rilevazione delle varianti virali mediante sequenziamento del genoma virale e tecniche di screening dedicate.

gianmaria.rossolini@unifi.it


“Dovrebbe essere chiaro che se si continuerà a deforestare, a mantenere allevamenti intensivi e mecati alimentari come quelli del Sud-Est asiatico, a costruire megalopoli, a inquinare l’aria che respiriamo con tonnellate di particolato ultrafine che infiamma le arterie e le arteriole del nostro organismo in età sempre più precoce, non potremo che assistere impotenti al rapido incremento di due fenomeni epidemiologici concomitanti e complementari. Da un lato la ‘transizione epidemiologica’ in atto da almeno tre decenni e consistente in un incremento continuo di malattie croniche con forte componente infiammatoria: aterosclerosi e patologie cardiovascolari, malattie endocrino-metaboliche e autoimmuni, cancro, malattie neurodegenerative e disturbi del neurosviluppo. Dall’altro il materializzarsi della temuta ‘era pandemica’ dovuta al continuo incremento di zoonosi, cioè all’emergere di sempre nuovi agenti patogeni in grado di fare il salto di specie dagli animali, da noi tenuti in condizioni penose e innaturali, all’uomo”

Ernesto Burgio, Wall Street International, 18.03.2021